【实验研究】CHAPS联合十二烷基硫酸钠的除垢剂动脉脱细胞支架材料制备

作者:梁远锋1,文  章2,刘尚敏3,黄淑佩4,郝俊海4,李东风3,林展翼3

单位:1.广东省心血管病研究所;2.华南理工大学;3.广东省人民医院;4.南方医科大学

采用3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)和十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)的联合除垢剂方案对脐动脉进行脱细胞,评价脱细胞的有效性和支架材料的力学性能改变情况。

分离新鲜脐带获取人脐动脉,通过对脐动脉进行CHAPS联合SDS脱细胞处理,获得脱细胞血管支架,对其进行苏木素-伊红、Masson、Verhoeff’s Van Gieson(EVG)等组织染色和扫描电镜分析,并进行DNA及胶原定量分析;于支架上接种成纤维细胞,通过细胞相容性的程度评估除垢剂残留情况;对血管支架材料进行爆破压力及应力应变曲线分析,评价支架材料力学性能改变。

组织染色结果显示脱细胞支架材料血管壁细胞消失,与未脱细胞的脐动脉相比较,其胶原纤维和弹力纤维结构无明显差别,电镜下可见血管细胞消失,支架材料成多孔隙结构;DNA定量显示DNA浓度极低,胶原蛋白浓度无明显改变;人成纤维细胞可以很好附着于支架材料上并生长;脱细胞支架材料抗爆破压力及应力应变曲线与脐动脉比较无明显变化。

CHAPS联合SDS的脱细胞方法能彻底去除脐动脉血管壁细胞成分,且较为完整地保留了血管的组织结构。脱细胞后的血管支架材料具有良好的生物相容性和力学性能。

血管脱细胞成为血管支架材料,是小口径血管移植物的重要研究方向之一[1]。理想的血管移植物应具有与原生血管相近的结构及原始力学性质,低免疫原性及良好的细胞生物相容性,利于血管再生及保持长时间通畅率等优势[2]。目前脱细胞化主要通过物理、化学和生物等方法去除组织细胞成分,保留细胞外基质而成为血管支架材料。除垢剂法是大多数研究所采用的方法,具有简单﹑彻底﹑破坏小等多方面优点。除垢剂可以大致分为3种,即以TritonX-100为代表的非离子除垢剂﹑以十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)及TritonX-200为代表的离子除垢剂,以3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)为代表的两性离子除垢剂[3]。既往文献报道脱细胞方法大都以SDS为主[4],也有报道以TritonX-100加其他物理化学的方法[5]。由于不同组织及除垢剂均有各自不同的特点,近来国外有文献报道[6],采用CHAPS及SDS两种除垢剂联合的方法对组织工程血管进行脱细胞,可以成为理想的血管支架材料,已经获得美国FDA批准进入三期临床试验,但此方法国内还没有相关文献报道。本研究参照国外文献报道的方法,在SDS的基础上加入相对温和的CHAPS除垢剂,以人脐动脉作为样本进行脱细胞方法摸索,检验脱细胞效果并尝试建立一套成熟的血管脱细胞方案。

1.1 主要仪器和试剂

荧光倒置显微镜(OLYMPUS IX73,日本),扫描电子显微镜(FEI Quanta200,美国),电子万能材料试验机(Instron 5967,美国),DMEM培养基、胎牛血清(Gibco,美国),PicoGreen试剂盒(invitrogen,美国),Hydroxyproline Assay kit (Colorimetric)试剂盒(Abcam,美国),CHAPS、SDS、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt,EDTA)、木瓜蛋白酶、青霉素、链霉素(SIGMA,美国),成人真皮成纤维细胞(北创生物BNCC,中国)。

1.2.1 人脐动脉的获取和脱细胞处理  制备脱细胞人脐动脉支架材料研究方案经广东省人民医院伦理道德委员会批准,选择产妇年龄为25~30岁、健康状况佳、胎龄(38~42 周)的新生儿脐带,脐带获取由产妇知情同意并自愿捐献。获取后立即置于4℃的PBS中,1 h内运回实验室作进一步处理。钝性分离脐带,取出脐动脉,细心剔除外层结缔组织,留取管腔内径≤6 mm的脐动脉,保证整段血管管壁厚度均匀,完整性良好,并用PBS反复冲洗,去除残留的血块血液。最后剪成5 cm片段,储存于4℃下含有青霉素100 U/mL及链霉素100 μg/mL的PBS中,用于下一步检测或进行脱细胞处理。将脐动脉片段放入CHAPS缓冲液(8 mmol/L CHAPS、1 mol/LNaCl、25 mmol/L EDTA)中摇晃24 h,PBS冲洗3次后,放入SDS缓冲液(1.8 mmol/L SDS、1mol/L NaCl、25 mmol/L EDTA)中摇晃24 h,PBS冲洗2 d。最后放入含10%胎牛血清(FBS)的PBS中漂洗1 d,最后用PBS冲洗。以上所有脱细胞步骤在37℃无菌环境下进行。

1.2.2 组织形态检测  脱细胞前后的血管分别用4%多聚甲醛固定,进行苏木素-伊红染色、Masson胶原纤维染色和Verhoeff’s Van Gieson(EVG)弹性纤维染色;2.5%戊二醛固定后进行扫描电子显微镜分析。

1.2.3 DNA和胶原成分定量检测  使用PicoGreen荧光定量测定脱细胞前后的脐动脉DNA浓度。先将血管冷冻干燥称重,再用木瓜蛋白酶溶液(125 μg/mL木瓜蛋白酶,5 mmol/L半胱氨酸及5 mmol/L EDTA)60℃下消化过夜。消化后的溶液用TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl及1 mmol/L EDTA,pH7.5)稀释,用等体积的Quant-iTTMPicoGreen dsDNA试剂孵育,在485 nm激发波长和530 nm发射波长下测定荧光值,根据标准品的浓度和对应的荧光值画出标准曲线方程,最后计算样本浓度。将冻干的血管片段用蒸馏水研磨后离心取上清液,使用Hydroxyproline Assay kit (Colorimetric)羟脯氨酸试剂盒,在450 nm波长处测得吸光值,根据标准品的浓度和对应的OD值画出标准曲线方程,最后计算样本的羟脯氨酸浓度。作为胶原蛋白浓度定量分析的特征性氨基酸,羟脯氨酸大约为胶原浓度的10%,因此,样本的胶原蛋白浓度为测出的羟脯氨酸浓度10倍[7]。

1.2.4 人成纤维细胞接种  将脱细胞血管一端用缝合线打结封闭,然后用成人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblasts,HDF)以1 x 106个/mL浓度注入血管管腔内,再封闭另一端。培养4 h后剪去两端缝合线并剪成5 mm × 3 mm贴片,将管腔面朝上放入12孔板,向每孔中各添加1 mL DMEM培养基。培养5 d后取出贴片,PBS冲洗干净后进行苏木素-伊红染色和扫描电镜分析。

1.2.5 力学性能检测  血管爆破压力采用静水压测试的方法,用50 mL注射器向血管内缓慢匀速注入PBS,使血管膨胀直至破裂,血管另一端连接高精度压力传感器(精度为±0.3%FS),结合NI数据采集系统对压力信号进行高频采集,准确捕捉爆破压力数值。将脱细胞前后的脐动脉沿纵轴剪开,裁剪成50 mm ×5 mm的长方形,沿长轴方向固定,使用Instron 5967进行拉伸应力测试,获取材料的应力应变曲线。先进行3个拉伸循环预处理至15%应变,再开始正式测量,拉伸速度一直保持为10 mm/min,拉直至断裂。在测试前和测试期间,血管组织用PBS保持湿润。

1.3 统计学分析

测量结果用IBM SPSS 22.0软件处理。所有数据以(均数±标准差)表示,采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结  果

2.1 联合除垢剂脱细胞处理对脐动脉组织结构的影响

新鲜分离的脐动脉通过对细胞组分、胶原纤维与弹性纤维染色来表征其存在与分布规律。苏木素-伊红染色使细胞核呈蓝色,胞浆及细胞外基质呈红色;Masson染色除了使胞浆呈红色,细胞核呈黑蓝色外,还能将胶原纤维呈蓝色;EVG染色使弹性纤维和细胞核呈黑色,胶原纤维呈红色。染色结果显示(见图1的A-F),脱细胞组的血管壁细胞彻底清除,脱细胞前后用Masson染色、EVG染色结果显示细胞外基质中的胶原纤维和弹性纤维在脱细胞血管中很好的保存下来。扫描电镜结果显示(见图1的G、H)未脱细胞的脐动脉血管腔内存在一层致密的内皮细胞层覆盖,其长轴方向与血流方向一致。脱细胞后的内皮细胞完全清除,仅保留了细胞外基质,纤维排列连续,形成直径3~15 μm不等的孔隙结构,脱细胞血管超微结构保持完整,为接下来的细胞黏附与生长提供了基础。

2.2 联合除垢剂脱细胞处理后血管支架材料的DNA残余测定结果

通过使用PicoGreen荧光染料与样品中DNA的高度特异性结合,产生荧光信号来精确定量样品中DNA浓度。PicoGreen技术可以检测到低达0.5 ng的DNA浓度变化。DNA的微量增加引起荧光信号强度或相对荧光单位(RFU)的显著增加。未脱细胞组和脱细胞组(n=8)的DNA定量分析结果分别为:(5503.125±771.358) ng/mg 、(12.375±4.104)ng/mg,两组比较差异有统计学意义(P<0.0001)。如图2所示,未脱细胞的血管里DNA浓度丰富,脱细胞后DNA完全清除,没有残留。

2.3 联合除垢剂脱细胞处理对血管组织胶原纤维浓度的影响

未脱细胞组和脱细胞组(n=10)的胶原定量分析结果分别为:31.691%±3.779%、35.563%±7.400%。如图3所示,脱细胞动脉中胶原浓度与未脱细胞动脉之间比较,差异无统计学意义(P>0.05),表明了该脱细胞方法对胶原的损伤较小,保留了大部分胶原纤维。脱细胞后胶原浓度增加,这可能是因为去除血管细胞后,样品的干重相对降低,导致胶原所占比重增加。

2.4 联合除垢剂脱细胞处理后血管支架材料的细胞相容性检验结果

理想的人工血管应具有良好的细胞相容性,支持细胞的黏附增殖。接种人成纤维细胞(human dermal fibroblasts,HDF)5d后,苏木素-伊红染色显示(图4A),细胞很好地黏附并均匀覆盖在脱细胞脐动脉管腔表面,形成近乎完整的细胞覆层。扫描电镜显示(图4B),细胞胞体大,为多突的纺锤形或星形的扁平细胞,具有突起,伸展良好。

2.5 联合除垢剂脱细胞处理后血管支架材料的力学性能变化

未脱细胞组和脱细胞组(n=5)的爆破压力结果分别为:(204.137±30.743)kPa、 (188.495±15.773)kPa。如图5所示脱细胞脐动脉爆破压力与未脱细胞脐动脉之间比较,差异无统计学意义(P>0.05),反映了脱细胞血管基质的抗爆破强度经脱细胞处理后无明显影响。未脱细胞组和脱细胞组(n=5)的最大应力分别为:(1.350±0.218)MPa、(1.256±0.142)MPa;其最大应变为124.990%±15.835%、111.047%±12.380%。两组最大应力、最大应变比较,差异无统计学意义(P>0.05),如图6A、图6B所示。脐动脉脱细胞前后2条应力应变曲线最大斜率接近,如图7所示,反映了脱细胞前后对血管基质拉伸的最大模量没有影响,这些数据表明脱细胞过程对人脐动脉拉伸性能无明显影响。

3  讨  论

人口老龄化及医学科学的进步,威胁人类生命的主要疾病谱已经由感染性疾病转变为包括血管性疾病在内的慢性疾病,全世界每年寻求血管重建和血管移植手术的患者正在大幅增加[5, 8]。目前大中口径血管(直径>6 mm)的移植已经可以使用涤纶和膨胀聚四氟乙烯(ePTFE)等高分子材料做成的人工血管,但小口径血管(直径≤6 mm)由于近期急性血栓事件发生率高,而远期由于移植血管壁增生导致通畅率低等情况[9-10],目前尚无理想的人工血管移植物。自体血管目前还是血管旁路移植物材料的最佳选择,然而受限于自体可用血管的数量和血管病变进展,自身移植物的使用存在一些限制, 包括质量差、长度有限、血管痉挛和感染等难题[11-12]。从再生医学的角度出发,自然衍生的生物材料形成的血管在未来小口径血管的开发中具有巨大潜能,其中包括了动物血管及组织工程培养的血管。从减少移植后免疫原性反应以及血管商品化等角度出发,血管移植物不可能包含活的细胞成分,必须经过脱细胞化处理形成细胞外基质(ECM)为主要骨架的脱细胞血管支架材料,它们具有修复、生长及重构的潜能,具备适合细胞附着和生存的微观孔隙结构,可接种多种细胞,以产生功能性组织[13]。

全世界许多研究团队尝试了许多不同的血管脱细胞方法,概括起来大致可以分为物理、化学和生物等主要方法,其中也包括联合几种不同的方法,利用各自的优点去除组织细胞成分,保留细胞外基质而成为血管支架材料[14]。除垢剂法具有简单、彻底、破坏小等多方面优点,容易控制实验条件,是目前较为成熟的脱细胞方法。近期,耶鲁大学Niklason团队应用体外生物反应器进行搏动压力环境下的平滑肌细胞三维培养,培养8周后形成理想的小口径组织工程血管,他们进而使用CHAPS和SDS两种除垢剂联合的方法对组织工程血管脱细胞成为血管支架材料,并成功在慢性肾功能衰竭患者身上进行血管移植,目前已经进入美国食品药品监督管理局(FDA)三期临床试验[15]。这种联合除垢剂的方法在国内外报道的并不多,大多数实验室采用的是脱细胞效率较高的SDS,而CHAPS脱细胞的作用相对比较温和。

本研究是在为数不多的国外文献报道的基础上,以人脐动脉作为研究标本,探索这种联合除垢剂的脱细胞方法。我们发现相比较于其他除垢剂脱细胞方法,正是由于CHAPS脱细胞的作用相对比较温和,脱细胞过程所需要的时间要明显延长,如前所言整个操作过程需要2~3 d。我们的研究结果显示,经过两种除垢剂各24 h脱细胞之后,无论是组织学检测还是DNA测定,都显示血管组织的细胞成分基本得到清除。而我们研究所进行的组织学检查还同时显示,这种联合除垢剂脱细胞方法清除细胞成分的同时,对血管壁的基本结构成分破坏不大,胶原纤维和弹力纤维排列结构基本没有变化,即使是胶原定量分析也同样显示跟脱细胞前的血管相比变化不大。扫描电镜清晰显示出脱细胞前脐动脉管腔的内皮细胞光滑平铺情况,脱细胞后彻底暴露内皮细胞底下的胶原纤维,高倍电镜下可见为3~15 μm不等的孔隙结构。为了检测经过长时间洗脱的脱细胞血管支架材料,我们还设计静水压抗爆破实验和Instron材料拉力机进行拉力测试,证实和未脱细胞的脐动脉相比较,脱细胞后的血管支架材料爆破静水压和应力应变曲线仅仅出现轻微下降,完全可以满足未来血管移植的缝合等要求。

由于除垢剂具有明显的细胞毒性,除垢剂脱细胞方法在完全脱去血管壁细胞之后,如何将其由支架中清洗出去的同时又不破坏支架材料的力学性能,是该方法的主要难点之一。除垢剂已经被证实与细胞外基质有强烈相互作用,并能改变基质材料的结构,包括基质材料的肿胀和不可逆的结构降解,变成凝胶状物体,从而影响其物理性能。我们研究设计使用人成纤维细胞种植的方法,通过观察该细胞能否在支架材料上种植下来以评判除垢剂的残留情况。本研究的结果显示,脱细胞之后经过PBS的多次漂洗,可以基本将除垢清除完全。经过5 d的培养,人成纤维细胞很好的黏附在支架材料表面,证明支架材料可以很好地支持细胞黏附和生长,具有良好的细胞生物相容性。

参考文献(略)

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